15.01.2023 | Leave a comment Содержание Requires — перевод, транскрипция, произношение, примерыМои примерыСловосочетанияПримерыПримеры, ожидающие переводаВозможные однокоренные словаrequire перевод и транскрипция, произношение, фразы и предложенияглаголприлагательноеФормы глаголаФразыПредложения 18.1: Транскрипция — с ДНК на РНК Основы: транскрипция in vitro | Thermo Fisher Scientific Быстрые ссылки Требования для транскрипции Системы перевода Варианты матриц: плазмиды, продукты ПЦР, олигонуклеотиды и кДНК Смысл или антисмысл? Традиционный или крупномасштабный синтез? Продукты для Ссылки Requires — перевод, транскрипция, произношение, примеры require амер. |rɪˈkwaɪərz| Тег audio не поддерживается вашим браузером. брит. |rɪˈkwaɪəz| Тег audio не поддерживается вашим браузером. — используется как present tense(he/she/it) для глагола to requireМои примерыСловосочетания a birdspeciesthat requires a specificenvironment — вид птиц, которому требуются особые природные условия an easysportthat requires littlephysicalexertion — лёгкий вид спорта, который не требует больших физических нагрузок situation requires calmness — ситуация требует спокойствия it requires carefulconsideration — это требует тщательного рассмотрения thismatter requires delicatehandling — этот вопрос требует осторожного подхода the matter requires despatch — это срочное дело thismanuscript requires no abridgement — эта рукопись не нуждается в сокращении thismanuscript requires no abridgment — эта рукопись не нуждается в сокращении requires immediateaction — требуется принятие немедленных мер when the occasion requires — в случае необходимости the subject requires amplification — вопрос требует разработки play the tuba requires good and plenty of wind — для того чтобы играть на тубе, нужно иметь хорошо поставленное сильное дыхание Примеры The job requires brains. Эта работа требует мозгов. This job requires special skills. Для этой работы нужны особые навыки. The house requires painting. Этот дом нуждается в покраске. The job requires a gentle touch. Эта работа требует мягкости. It requires vigilance on our part. Это требует бдительности с нашей стороны. It requires careful consideration. Это требует тщательного рассмотрения. The job requires special training. Эта работа требует специальной подготовки. Skydiving requires both skill and daring. Прыжки с парашютом требуют как мастерства, так и смелости. His job requires him to travel frequently. Работа требует от него частых путешествий. Becoming a doctor requires years of study. Чтобы стать врачом, нужно много лет учиться. For such a plan to work requires discipline. Для разработки такого плана требуется дисциплина. It’s a problem that requires careful analysis. Это проблема, которая требует тщательного анализа. The job requires nerves of steel. Для этой работы требуются стальные нервы. The job requires manual dexterity. Эта работа требует ловкости рук. The subject requires amplification. Вопрос требует разработки. The subject requires some exposition. Данный вопрос требует определённого разъяснения. This patient requires intensive care. Этому пациенту необходимо интенсивное лечение. The job requires attention to detail. Работа требует внимания к деталям. This problem requires clear thinking. Для решения этой проблемы требуется ясная голова. It requires the most vigorous efforts. Это требует самых энергичных действий. The matter requires delicate handling. Дело требует особого подхода. This requires your immediate attention. Это требует вашего немедленного внимания. The job requires a man with a lot of go. Для этой работы требуется очень энергичный человек. The work requires intense concentration. Эта работа требует глубокой концентрации внимания. This crisis requires a measured response. Этот кризис требует взвешенного ответа. Any school trip requires careful planning. Любая школьная экскурсия требует тщательного планирования. Editing requires great attention to detail. Редактирование текстов требует большого внимания к деталям. A good shot requires good balance and tempo. Хороший удар требует хорошего баланса и чувства темпа. The job requires you to be computer literate. Эта работа требует от вас, умения обращаться с компьютером. The wall is weak and requires lateral support. Эта стена — ненадёжная, и требует боковой опоры. ещё 23 примера свернутьПримеры, ожидающие перевода It’s a job that requires a grown man. The job requires tact and diplomacy. The yard requires very little upkeep. Для того чтобы добавить вариант перевода, кликните по иконке ☰, напротив примера.Возможные однокоренные словаrequire — требовать, нуждаться, затребовать, приказыватьДополнение / ошибка Добавить примерВ других словарях: Мультитран Webster FreeDictionary Longman Forvo require перевод и транскрипция, произношение, фразы и предложения [rɪˈkwaɪə]глагол требовать (нуждаться, приказывать, потребоваться, предполагать, понадобиться, обязывать)прилагательное обязательныйСинонимы: obligative, binding, bounden, obligated, obliging, preceptive.Формы глаголаЕд. числоМнож. числоPresent Simple (Настоящее время)I requireWe requireYou requireYou requireHe/She/It requiresThey requirePast Simple (Прошедшее время)I requiredWe requiredYou requiredYou requiredHe/She/It requiredThey requiredФразыrequiring proofтребовать доказательстваrequire foodнуждаться в пищеrequired subjectобязательный предметПредложенияMaybe in a different universe, our basic five senses are useless and we would require different senses altogether.Возможно, в другой вселенной наши пять основных чувств будут бесполезны, и нам понадобятся совершенно другие чувства.Why does that require an apology?Почему за это нужно извиняться?I’ll call you if I require your assistance. Я позвоню тебе, если мне понадобится твоя помощь.Do you require our help?Тебе нужна наша помощь?Nature made sure that living happily doesn’t require much effort: everyone can make himself happy.Природа позаботилась о том, чтобы для счастливой жизни не требовалось больших усилий: каждый может сделать себя счастливым.The art of modern warfare does not necessarily require soldiers to be armed to the teeth to be effective as combatants.Искусство современной войны необязательно требует вооружать до зубов солдат для того, чтобы они были эффективны в бою.Different jobs require different tools.Для разных видов работы нужны разные инструменты.It doesn’t require a scholar to interpret.Чтобы это разобрать не нужен учёный.The school rules require students to wear school uniforms.Школьные правила требуют, чтобы студенты носили школьную форму.I require absolute loyalty from all my employees. Я требую абсолютной преданности от своих работников.Smart shopping requires careful planning.Умный шоппинг требует тщательного планирования.This is the kind of work that requires a high level of concentration.Это такая работа, которая требует большого уровня концентрации.To strive against the stream requires courage.Для того, чтобы плыть против течения, нужно мужество.The house requires repairs.Дом требует ремонта.Tom requires special attention.Том требует особого внимания.As George Bush has amply demonstrated, being president of the U.S. requires only a modicum of intelligence.Как убедительно продемонстрировал Джордж Буш, достаточно всего капельки интеллекта, чтобы стать президентом США.Learning English requires patience.Изучение английского требует терпения.This matter requires careful thought.Этот вопрос нужно хорошо обдумать.My question requires a response. Мой вопрос нуждается в ответе.To climb steep hills requires a slow pace at first.Чтобы забраться на крутой холм, сначала нужно идти медленным шагом.The Romans would never have had enough time for conquering the world if they had first been required to study Latin.У римлян ни за что не хватило бы времени на завоевание мира, если бы им пришлось сперва изучать латынь.You’re required by law to appear in person.Личная явка обязательна по закону.I would like to but I have a required course tonight.Я бы с удовольствием, но у меня сегодня вечером обязательное занятие.The students were required to learn the Constitution by heart.От студентов требовали выучить Конституцию наизусть.Tom had the skill set required to successfully do the job.У Тома были необходимые навыки, чтобы успешно сделать работу.Employees are required to wear uniforms.Работники должны носить униформу.Tickets aren’t required for tonight’s concert.На сегодняшний ночной концерт билеты не нужны.He required her to explain how she spent money.Он потребовал, чтобы она объяснила, как потратила деньги.On the Internet, in most cases, any required information is available for free.В Интернете, в большинстве случаев, искомая информация доступна бесплатно.Foreigners in general don’t need as many compliments as Japanese are required to give each other, and it is good to keep this in mind.Иностранцы обычно не нуждаются в таком обилии комплиментов, которыми японцам необходимо обмениваться между собой, и это полезно иметь в виду. 18.1: Транскрипция — с ДНК на РНК Последнее обновление Сохранить как PDF Идентификатор страницы 8533 Краткое содержание раздела Бактерии, археи и эукариоты должны транскрибировать гены из своих геномов. В то время как клеточное расположение может быть различным (эукариоты осуществляют транскрипцию в ядре, бактерии и археи осуществляют транскрипцию в цитоплазме), механизмы, с помощью которых организмы из каждой из этих клад осуществляют этот процесс, принципиально одинаковы и могут быть охарактеризованы тремя стадиями. : инициация, элонгация и терминация. Краткий обзор транскрипции Транскрипция — это процесс создания РНК-копии сегмента ДНК. Поскольку это процесс , мы хотим применить рубрику «Энергетическая история» для выработки функционального понимания транскрипции. Как выглядит система молекул до начала транскрипции? Как это выглядит в конце? Какие превращения материи и переносы энергии происходят при транскрипции и что катализирует этот процесс? Мы также хотим рассмотреть этот процесс с точки зрения Design Challenge. Если биологическая задача состоит в том, чтобы создать копию ДНК на химическом языке РНК, какие проблемы, которые мы можем разумно предположить или предвидеть, учитывая наши знания о других процессах нуклеотидных полимеров, должны быть преодолены? Есть ли свидетельства того, что Природа решала эти проблемы по-разному? Каковы, по-видимому, критерии успеха транскрипции? Вы поняли идею. Перечислим некоторые основные требования к транскрипции Давайте сначала рассмотрим поставленные задачи, используя некоторые из наших фундаментальных знаний и представив, что может произойти во время транскрипции, если целью является создание РНК-копии фрагмента. одной цепи двухцепочечной молекулы ДНК. Мы увидим, что использование некоторой базовой логики позволяет нам сделать вывод о многих важных вопросах и вещах, которые нам необходимо знать, чтобы правильно описать процесс. Давайте представим, что мы хотим сконструировать наномашину/нанобота, который будет осуществлять транскрипцию. Мы можем использовать некоторые подходы к задаче проектирования, чтобы определить проблемы и подзадачи, которые должен решить наш маленький робот. • Где должна запускаться машина? Куда должна быть направлена машина от миллионов до миллиардов пар оснований? • Где должна остановиться машина? • Если у нас есть начальный и конечный сайты, нам потребуются способы кодирования этой информации, чтобы наши машины могли прочитать эту информацию — как это будет достигнуто? • Сколько РНК-копий ДНК нам нужно будет сделать? • Как быстро нужно делать копии РНК? • Насколько точно должны быть сделаны копии? • Сколько энергии потребуется для процесса и откуда она будет браться? Конечно, это лишь некоторые из основных вопросов. При желании можно копнуть глубже. Тем не менее, они уже достаточно хороши, чтобы мы начали хорошо чувствовать этот процесс. Заметьте также, что многие из этих вопросов удивительно похожи на те, которые, как мы предполагали, могут быть необходимы для понимания репликации ДНК. Строительные блоки транскрипции Строительные блоки РНК Вспомним из нашего обсуждения структуры нуклеотидов, что строительные блоки РНК очень похожи на строительные блоки ДНК. В РНК строительные блоки состоят из нуклеотидтрифосфатов, которые состоят из сахара рибозы, азотистого основания и трех фосфатных групп. Ключевые различия между строительными блоками ДНК и РНК состоят в том, что молекулы РНК состоят из нуклеотидов с сахарами рибозы (в отличие от сахаров дезоксирибозы) и используют уридин, содержащий урацил нуклеотид (в отличие от тимидина в ДНК). Обратите внимание, что урацил и тимин структурно очень похожи — в урациле просто отсутствует метил (CH 3 ) функциональная группа по сравнению с тимином. Рисунок 1 . Основные химические компоненты нуклеотидов. Атрибуция: Marc T. Facciotti (оригинальная работа) Инициация транскрипции Промоторы Белки, ответственные за создание РНК-копии определенного фрагмента ДНК (начало транскрипции), должны сначала быть в состоянии распознать начало копируемый элемент. Промотор представляет собой последовательность ДНК, с которой различные белки, известные под общим названием «машина транскрипции», связываются и инициируют транскрипцию. В большинстве случаев промоторы существуют выше (5′ от кодирующей области) генов, которые они регулируют. Конкретная последовательность промотора очень важна, потому что она определяет, будет ли соответствующая кодирующая часть гена транскрибироваться все время, время от времени или нечасто. Хотя промоторы различаются у разных видов, иногда сохраняется несколько элементов схожей последовательности. В областях -10 и -35 перед сайтом инициации есть два промотора 9.0024 консенсусные последовательности или области, которые сходны для многих промоторов и для разных видов. Некоторые промоторы будут иметь последовательность, очень похожую на консенсусную последовательность (последовательность, содержащую наиболее распространенные элементы последовательности), а другие будут выглядеть совсем иначе. Эти вариации последовательности влияют на силу, с которой механизм транскрипции может связываться с промотором, чтобы инициировать транскрипцию. Это помогает контролировать количество сделанных расшифровок и частоту их выполнения. Рисунок 2 . а) Общая схема гена. Ген включает промоторную последовательность, нетранслируемую область (UTR) и кодирующую последовательность. (b) Список нескольких сильных промоторных последовательностей E. coli. Блок -35 и блок -10 представляют собой высококонсервативные последовательности во всем списке сильных промоторов. Более слабые промоторы будут иметь больше различий в парах оснований по сравнению с этими последовательностями. Источник: http://www.discoveryandinnovation.co…lecture12.html Примечание: возможна дискуссия Какие типы взаимодействий изменяются между механизмом транскрипции и ДНК при изменении нуклеотидной последовательности промотора? Почему некоторые последовательности создают «сильный» промотор, а другие — «слабый»? Бактериальные и эукариотические промоторы В бактериальных клетках консенсусная последовательность -10, называемая областью -10, богата АТ, часто ТАТААТ. Последовательность -35, TTGACA, распознается и связывается белком 9.0072 о . Как только это взаимодействие белок-ДНК происходит, субъединицы основной РНК-полимеразы связываются с участком. Из-за относительно меньшей стабильности АТ-ассоциаций АТ-богатая область -10 способствует раскручиванию ДНК-матрицы и образованию нескольких фосфодиэфирных связей. Эукариотические промоторы намного больше и сложнее, чем прокариотические промоторы, но оба имеют АТ-богатую область — у эукариот ее обычно называют ТАТА-боксом. Например, в гене тимидинкиназы мыши бокс ТАТА расположен примерно на -30. Для этого гена точной последовательностью ТАТА-бокса является ТАТАААА, прочитанная в направлении от 5′ к 3′ на нематричной цепи. Эта последовательность не идентична E. coli -10, но оба имеют общее качество AT-богатого элемента. Вместо одной бактериальной полимеразы геномы большинства эукариот кодируют три разные РНК-полимеразы, каждая из которых состоит из десяти или более белковых субъединиц. Каждой эукариотической полимеразе также требуется отдельный набор белков, известных как факторов транскрипции , чтобы привлечь ее к промотору. Кроме того, целый ряд других факторов транскрипции, белков, известных как энхансеры, и сайленсеры помогают регулировать синтез РНК с каждого промотора. Энхансеры и сайленсеры влияют на эффективность транскрипции, но не являются необходимыми для инициации транскрипции или ее процессии. Базальные факторы транскрипции имеют решающее значение в формировании преинициаторный комплекс на ДНК-матрице, который впоследствии привлекает РНК-полимеразу для инициации транскрипции. Инициация транскрипции начинается со связывания РНК-полимеразы с промотором . Для транскрипции требуется, чтобы двойная спираль ДНК частично раскручивалась, чтобы одну из цепей можно было использовать в качестве матрицы для синтеза РНК. Область раскручивания называется транскрипционным пузырем . Рисунок 3 . Во время элонгации РНК-полимераза отслеживает ДНК-матрицу, синтезирует мРНК в направлении от 5′ к 3′ и раскручивает, а затем перематывает ДНК по мере ее считывания. Элонгация Транскрипция всегда происходит с матричной цепи , одной из двух цепей двухцепочечной ДНК. Продукт РНК комплементарен матричной цепи и почти идентичен нематричной цепи, называемой кодирующей цепью , за исключением того, что РНК содержит урацил (U) вместо тимина (T), обнаруженного в ДНК. Во время удлинения фермент под названием РНК-полимераза движется по матрице ДНК, добавляя нуклеотиды путем спаривания оснований с матрицей ДНК способом, сходным с репликацией ДНК, с той разницей, что синтезированная цепь РНК не остается связанной с матрицей ДНК. По мере удлинения ДНК непрерывно раскручивается перед коровым ферментом и закручивается позади него. Обратите внимание, что направление синтеза идентично направлению синтеза в ДНК — от 5′ к 3′. Рисунок 4 . Во время элонгации РНК-полимераза отслеживает ДНК-матрицу, синтезируя мРНК в направлении от 5′ к 3′, раскручивая и затем перематывая ДНК по мере ее считывания. Рисунок 5 . Добавление нуклеотидов в процессе транскрипции очень похоже на добавление нуклеотидов при репликации ДНК. РНК полимеризуется от 5′ к 3′, и с каждым добавлением нуклеотида фосфоангидридная связь гидролизуется ферментом, что приводит к более длинному полимеру и высвобождению двух неорганических фосфатов. Источник: http://utminers.utep.edu/rwebb/html/…longation.html Примечание: возможная дискуссия Сравните и сопоставьте историю энергии для добавления нуклеотида в репликации ДНК с добавлением нуклеотида в транскрипцию. Бактериальное и эукариотическое удлинение У бактерий удлинение начинается с высвобождения субъединицы σ из полимеразы. Диссоциация σ позволяет коровому ферменту двигаться по ДНК-матрице, синтезируя мРНК в направлении от 5′ к 3′ со скоростью примерно 40 нуклеотидов в секунду. По мере удлинения ДНК непрерывно раскручивается перед коровым ферментом и закручивается позади него. Спаривание оснований между ДНК и РНК недостаточно стабильно, чтобы поддерживать стабильность компонентов синтеза мРНК. Вместо этого РНК-полимераза действует как стабильный линкер между матрицей ДНК и зарождающимися цепями РНК, чтобы гарантировать, что удлинение не прервется преждевременно. У эукариот после образования преинициаторного комплекса полимераза высвобождается из других факторов транскрипции, и элонгация может происходить, как это происходит у прокариот, когда полимераза синтезирует пре-мРНК в направлении от 5′ к 3′. Как обсуждалось ранее, РНК-полимераза II транскрибирует большую часть эукариотических генов, поэтому в этом разделе основное внимание будет уделено тому, как эта полимераза осуществляет элонгацию и терминацию. Завершение В бактериях После того, как ген транскрибирован, бактериальной полимеразе необходимо дать указание диссоциировать от ДНК-матрицы и высвободить новообразованную мРНК. В зависимости от транскрибируемого гена существует два вида сигналов терминации. Один основан на белке, а другой на основе РНК. Rho-зависимая терминация контролируется белком rho, который следует за полимеразой на растущей цепи мРНК. Ближе к концу гена полимераза встречает серию нуклеотидов G на матрице ДНК и останавливается. В результате белок rho сталкивается с полимеразой. Взаимодействие с rho высвобождает мРНК из транскрипционного пузыря. Rho-независимая терминация контролируется специфическими последовательностями в матричной цепи ДНК. Когда полимераза приближается к концу транскрибируемого гена, она сталкивается с областью, богатой нуклеотидами CG. мРНК сворачивается сама по себе, и комплементарные нуклеотиды CG связываются вместе. В результате получается стабильная шпилька , которая заставляет полимеразу останавливаться, как только она начинает транскрибировать область, богатую АТ-нуклеотидами. Комплементарный участок UA транскрипта мРНК образует лишь слабое взаимодействие с матричной ДНК. Это, в сочетании с остановленной полимеразой, вызывает достаточную нестабильность для того, чтобы коровый фермент оторвался и высвободил новый транскрипт мРНК. У эукариот Терминация транскрипции различна для разных полимераз. В отличие от прокариот, элонгация РНК-полимеразой II у эукариот происходит на 1000–2000 нуклеотидов за конец транскрибируемого гена. Этот хвост пре-мРНК впоследствии удаляется расщеплением во время процессинга мРНК. С другой стороны, РНК-полимеразы I и III нуждаются в сигналах терминации. Гены, транскрибируемые РНК-полимеразой I, содержат специфическую последовательность из 18 нуклеотидов, которая распознается терминирующим белком. Процесс терминации у РНК-полимеразы III включает шпильку мРНК, сходную с ро-независимой терминацией транскрипции у прокариот. У архей Терминация транскрипции у архей изучена гораздо меньше, чем в двух других областях жизни, и еще недостаточно изучена. Хотя функциональные детали, вероятно, напоминают механизмы, которые наблюдались в других сферах жизни, эти детали выходят за рамки этого курса. Расположение в клетке У бактерий и архей У бактерий и архей транскрипция происходит в цитоплазме, где находится ДНК. Поскольку расположение ДНК и, следовательно, процесс транскрипции физически не отделены от остальной части клетки, трансляция часто начинается до завершения транскрипции. Это означает, что мРНК у бактерий и архей используется в качестве матрицы для белка до того, как будет произведена вся мРНК. Отсутствие пространственной сегрегации также означает, что для этих процессов очень мало временной сегрегации. На рис. 6 показаны процессы транскрипции и трансляции, происходящие одновременно. Рисунок 6 . Добавление нуклеотидов в процессе транскрипции очень похоже на добавление нуклеотидов при репликации ДНК. Источник: Марк Т. Фаччиотти (собственная работа) У эукариот…. У эукариот процесс транскрипции физически отделен от остальной части клетки, изолирован внутри ядра. Это приводит к двум вещам: мРНК завершается до того, как может начаться трансляция, и есть время «настроить» или «отредактировать» мРНК до начала трансляции. Физическое разделение этих процессов дает эукариотам возможность изменить мРНК таким образом, чтобы продлить срок жизни мРНК или даже изменить белковый продукт, который будет произведен из мРНК. Процессинг мРНК 5′-G-кэп и 3′-поли-А-хвост При транскрипции эукариотического гена первичный транскрипт процессируется в ядре несколькими способами. Эукариотические мРНК модифицируются на 3′-конце путем добавления поли-А-хвоста. Эта серия остатков А добавляется ферментом, который не использует геномную ДНК в качестве матрицы. Кроме того, мРНК имеют химическую модификацию 5′-конца, называемую 5′-кэпом. Данные свидетельствуют о том, что эти модификации помогают увеличить продолжительность жизни мРНК (предотвращают ее преждевременную деградацию в цитоплазме), а также помогают мРНК инициировать трансляцию. Рисунок 7 . пре-мРНК обрабатываются в несколько этапов. Интроны удаляют, добавляют 5′-кэп и поли-А-хвост. Источник: http://www.discoveryandinnovation.co…lecture12.html Альтернативный сплайсинг Сплайсинг происходит на большинстве эукариотических мРНК, в которых интроны удалены из последовательности мРНК, а экзоны лигированы вместе. Это может создать гораздо более короткую мРНК, чем изначально расшифрованная. Сплайсинг позволяет клеткам смешивать и сопоставлять, какие экзоны включаются в конечный продукт мРНК. Как показано на рисунке ниже, это может привести к тому, что несколько белков будут кодироваться одним геном. Рисунок 8 . Информация, хранящаяся в ДНК, конечна. В некоторых случаях организмы могут смешивать и сопоставлять эту информацию для создания различных конечных продуктов. У эукариот альтернативный сплайсинг позволяет создавать различные продукты мРНК, которые, в свою очередь, используются при трансляции для создания различных белковых последовательностей. В конечном итоге это приводит к образованию белков различной формы и, следовательно, к разным функциям белков. Источник: http://www.discoveryandinnovation.co…lecture12.html Наверх Была ли эта статья полезной? Тип изделия Раздел или Страница Показать оглавление нет Теги На этой странице нет тегов. Основы: транскрипция in vitro | Thermo Fisher Scientific Возможность синтезировать РНК в лаборатории имеет решающее значение для многих методов. РНК-зонды с радиоактивной и неизотопной меткой, генерируемые в реакциях транскрипции небольшого масштаба, могут использоваться в блот-гибридизациях и анализах защиты от нуклеаз. Такие зонды намного более чувствительны, чем ДНК-зонды со случайным праймированием. Реакции небольшого масштаба также можно использовать для синтеза транскриптов РНК, содержащих модифицированные нуклеотиды, для различных биохимических и молекулярно-биологических исследований. Крупномасштабные реакции транскрипции, генерирующие до 200 мкг РНК за реакцию, могут использоваться для амплификации аРНК, исследований экспрессии (микроинъекция, заражение вирусными транскриптами, in vitro перевод), структурный анализ (связывание белок-РНК) и механистические исследования (анализ рибозимов). В этой статье мы представляем обзор транскрипции, включая требования реакций транскрипции in vitro и сравнение обычного и крупномасштабного синтеза РНК. Быстрые ссылки Требования РНК-фаговые полимеразы Варианты матриц Смысловые и антисмысловые Традиционные или крупномасштабные? Продукты Требования для транскрипции Для транскрипции in vitro требуется очищенная линейная ДНК-матрица, содержащая промотор, рибонуклеотидтрифосфаты, буферную систему, включающую DTT и ионы магния, и подходящую фаговую РНК-полимеразу. Точные условия, используемые в реакции транскрипции, зависят от количества РНК, необходимого для конкретного применения. . Верх Системы перевода Лизат ретикулоцитов кролика Лизат ретикулоцитов кролика представляет собой высокоэффективную систему синтеза эукариотического белка in vitro, используемую для трансляции экзогенных РНК (либо природных, либо созданных in vitro). In vivo ретикулоциты представляют собой высокоспециализированные клетки, в первую очередь ответственные за синтез гемоглобина, который составляет более 90% белка, вырабатываемого ретикулоцитом. Эти незрелые эритроциты уже потеряли свои ядра, но содержат адекватную мРНК, а также полный аппарат трансляции для интенсивного синтеза глобина. Эндогенная мРНК глобина может быть удалена инкубацией с Са2+-зависимой микрококковой нуклеазой, которая позже инактивируется хелатированием Са2+ с помощью EGTA. Мы предлагаем лизат ретикулоцитов, обработанный нуклеазой Invitrogen™. Этот тип лизата является наиболее широко используемой РНК-зависимой бесклеточной системой из-за его низкого фона и эффективного использования экзогенных РНК даже в низких концентрациях (рис. 1). Экзогенные белки синтезируются со скоростью, близкой к наблюдаемой в интактных ретикулоцитарных клетках. Рис. 1. Стандартная процедура трансляции in vitro с использованием лизата ретикулоцитов кролика или экстракта зародышей пшеницы. Необработанный лизат ретикулоцитов транслирует эндогенную глобиновую мРНК, экзогенную РНК или и то, и другое. Этот тип лизата обычно используется для изучения механизма трансляции, например, для изучения влияния ингибиторов на трансляцию глобина. Как необработанные, так и обработанные лизаты ретикулоцитов кролика обладают низкой нуклеазной активностью и способны синтезировать большое количество полноразмерного продукта. Оба лизата подходят для синтеза более крупных белков из кэпированных или некэпированных РНК (эукариотических или вирусных). Top Варианты матриц: плазмиды, продукты ПЦР, олигонуклеотиды и кДНК Матрица ДНК должна содержать двухцепочечную промоторную область, где фаговая полимераза связывается и инициирует синтез РНК. Матрицы транскрипции включают плазмидные конструкции, созданные путем клонирования, матрицы кДНК, полученные путем синтеза первой и второй нити из предшественника РНК (например, амплификация аРНК), и линейные матрицы, полученные с помощью ПЦР или отжига химически синтезированных олигонуклеотидов. Плазмиды Многие распространенные плазмидные векторы для клонирования включают промоторы фаговой полимеразы. Они часто содержат два разных промотора, по одному с каждой стороны сайта множественного клонирования, что позволяет транскрипцию любой цепи вставленной последовательности. Такие векторы с двойным противоположным промотором включают векторы pDP от Invitrogen, pGEM от Promega, pBluescript от Stratagene и pCRII от Invitrogen. Семейство векторов Invitrogen™ pTRIPLEscript™ содержит все три промотора фаговых полимераз в тандеме (на одной стороне сайта множественного клонирования), что позволяет использовать любую из трех полимераз, SP6, T7 или T3. Плазмидные векторы, используемые в качестве транскрипционных матриц, должны быть линеаризованы путем расщепления рестрикционными ферментами. Поскольку транскрипция продолжается до конца матрицы ДНК, линеаризация гарантирует создание транскриптов РНК определенной длины и последовательности. Сайт рестрикции не обязательно должен быть уникальным, и при условии, что промотор остается рядом с матрицей транскрипции, сам вектор может быть расщеплен несколько раз. Также нет необходимости очищать последовательность промотор-вставка от других фрагментов перед транскрипцией, поскольку только фрагмент, содержащий промоторную последовательность, будет служить матрицей. За расщеплением ферментами рестрикции должна следовать очистка, поскольку примеси в реакции переваривания могут ингибировать транскрипцию. Продукты ПЦР Продукты ПЦР также могут служить матрицами для транскрипции. Промотор можно добавить к продукту ПЦР, включив промоторную последовательность на 5′-конце либо прямого, либо обратного праймера для ПЦР. Эти основания становятся двухцепочечной промоторной последовательностью во время реакции ПЦР. Олигонуклеотиды Два олигонуклеотида также можно использовать для создания коротких транскрипционных матриц. Два комплементарных олигонуклеотида, содержащих последовательность промотора фага, просто отжигают, чтобы получить матрицу двухцепочечной ДНК. Только часть ДНК-матрицы — от -17 до +1 основания промотора РНК-полимеразы — должна быть двухцепочечной. Поэтому может быть более экономичным синтезировать один короткий и один длинный олигонуклеотид, создавая асимметричный гибрид (см. «Минимальные требования к последовательности»). кДНК Более поздняя транскрипция in vitro используется в реакциях амплификации аРНК. Для этих реакций матрицы транскрипции создаются из РНК с использованием промоторного праймера Invitrogen™ oligo(dT)-T7 во время обратной транскрипции. кДНК превращается в двухцепочечную матрицу транскрипции с помощью реакции синтеза второй цепи. Верх Смысл или антисмысл? При разработке шаблона транскрипции необходимо решить, нужны ли смысловые или антисмысловые транскрипты. Если РНК предполагается использовать в качестве зонда для гибридизации с матричной РНК (например, нозерн-блоты, гибридизации in situ и анализы защиты от нуклеаз), требуются комплементарные антисмысловые транскрипты. Напротив, транскрипты смысловой цепи используются при проведении экспрессионных, структурных или функциональных исследований или при построении стандартной кривой для количественного определения РНК с использованием искусственной смысловой цепи РНК. Последовательность +1G промотора РНК-полимеразы в матрице ДНК является первым основанием, включенным в продукт транскрипции. Чтобы РНК имела смысл, 5′-конец кодирующей цепи должен быть рядом или сразу после +1G промотора. Для транскрипции антисмысловой РНК 5′-конец некодирующей цепи должен быть смежным с +1G. Если вставка находится в векторе, вектор должен быть линеаризован ниже промотора, а вставленная последовательность должна быть транскрибирована (см. Разве это не имеет смысла?»). Верх Традиционный или крупномасштабный синтез? Реакции транскрипции in vitro можно разделить на два типа: обычные и крупномасштабные. Обычные реакции обычно используются для синтеза радиоактивно меченых РНК-зондов или для включения модифицированных нуклеотидов в транскрипты. Крупномасштабные реакции, которые производят> 100 мкг РНК за реакцию, полезны для структурных исследований и исследований экспрессии, а также для амплификации аРНК. Традиционные реакции: синтез меченых РНК-зондов или модифицированных транскриптов Обычные условия реакции, такие как условия, используемые в наборе Invitrogen™ MAXIscript™, используют относительно низкие концентрации нуклеотидов (0,5 мМ каждая). В более высоких концентрациях нуклеотидов нет необходимости, поскольку в этих реакциях низкая концентрация присутствующих радиоактивно меченых или модифицированных нуклеотидов эффективно ограничивает общий выход реакции. Общая концентрация ограничивающего нуклеотида (меченого/модифицированного и немеченого) должна составлять не менее 3 мкМ для эффективного синтеза полноразмерных РНК-транскриптов <400 нуклеотидов (для синтеза более длинных транскриптов потребуется больше). Концентрация 3 мкМ радиоактивно меченого rNTP может быть получена путем добавления 5 мкл раствора [α-32P] NTP с концентрацией 800 Ки/ммоль, 10 мКи/мл (или 12,5 мкМ). Доступны меченые rNTP с более высокой удельной активностью, но они предоставляются при гораздо более низкой исходной молярной концентрации (например, 3000 Ки/ммоль, 10 мКи/мл имеют исходную концентрацию всего 3,3 мкМ). Без добавления немеченого НТФ невозможно достичь конечной минимальной реакционной концентрации 3 мкМ. Поскольку ограничение концентрации нуклеотидов может привести к преждевременной терминации транскрипции, существует компромисс между синтезом транскриптов с высокой специфической активностью (или сильно модифицированных) и полноразмерных транскриптов. Разбавление ограниченного радиоактивно меченого или модифицированного нуклеотида немеченым нуклеотидом пропорционально снижает специфическую активность (или степень модификации) транскрипта, но дает более полноразмерный транскрипт. Чтобы получить очень высокую специфическую активность или сильно модифицированные транскрипты, следует ограничить или исключить любые присутствующие немеченые ограничивающие нуклеотиды. При транскрипции РНК с матриц, в которых отсутствуют CTP и TTP в 12 основаниях непосредственно ниже места начала транскрипции, можно преодолеть ограничивающий минимум нуклеотидов в 3 мкМ (1). Технология CU Minus Promoter от Invitrogen предлагает векторы, содержащие промоторы CTP и TTP-минус РНК-полимеразы, а также конверсионные праймеры, которые можно использовать для устранения оснований CTP и TTP из промоторов РНК-полимеразы в существующих векторах. Такие матрицы производят высокую долю полноразмерных транскриптов в реакциях, содержащих всего лишь 0,165 мкМ общего лимитирующего нуклеотида. Используя технологию CU Minus, теперь можно получить радиоактивно меченые нуклеотиды с самой высокой удельной активностью путем транскрипции in vitro без добавления немеченых нуклеотидов. В результате могут быть транскрибированы РНК-зонды с в 7,5 раз более высокой удельной активностью. Крупномасштабный синтез: для изучения структуры и экспрессии, а также для амплификации аРНК Крупномасштабные реакции транскрипции in vitro могут давать до 120–180 мкг РНК на микрограмм матрицы в реакции объемом 20 мкл. Новая запатентованная технология, разработанная Invitrogen (например, технология MEGAscript™, см. ниже), позволяет фаговым РНК-полимеразам оставаться активными при высоких концентрациях нуклеотидов, которые обычно ингибируют фермент. Выходы этих крупномасштабных реакций обычно в 10–50 раз выше, чем при обычных реакциях транскрипции (без каких-либо ограничивающих нуклеотидов). Условия реакции (например, тип нуклеотидной соли, тип и концентрация соли в транскрипционном буфере, концентрация фермента и pH) оптимизируются не только для каждой полимеразы, но и для всего набора компонентов. Только при этих условиях можно добиться оптимального урожая. Верх Продукты для in vitro транскрипция Invitrogen предлагает полную линейку продуктов для транскрипции in vitro. Набор MAXIscript идеально подходит для изготовления радиоактивно- и неизотопно-меченых РНК-зондов для использования в гибридизациях. Зонды, созданные с помощью наборов для синтеза и удаления РНК-зондов Invitrogen™ Strip-EZ™, легко удаляются из нозерн-блотов, что позволяет провести много раундов гибридизации без повреждения нуклеиновой кислоты, связанной с блотом. Семейство наборов MEGAscript использует высокопроизводительную запатентованную технологию Invitrogen для синтеза РНК для приложений, требующих больших массовых количеств. Большое количество кэпированных РНК-транскриптов можно синтезировать с помощью набора Invitrogen™ mMESSAGE mMACHINE™, используя ту же запатентованную технологию с высоким выходом. При желании набор Invitrogen™ Poly(A) Tailing Kit можно использовать для добавления поли(A)-хвоста к кэпированным РНК-транскриптам, синтезированным с помощью набора mMESSAGE mMACHINE. Набор для аРНК Invitrogen™ MessageAmp™ представляет собой полный набор для амплификации аРНК на основе запатентованного метода Эбервайна. Включая технологию высокопроизводительной транскрипции MEGAscript, этот набор включает все необходимые реагенты для синтеза первой цепи кДНК, расщепления РНКазой H, синтеза второй цепи, очистки кДНК, транскрипции in vitro и очистки аРНК. Верх Ссылки Линг М-Л, Рисман С.С., Клемент Дж.