05.12.2022 | Leave a comment Содержание перевод, произношение, транскрипция, примеры использованияМои примерыСловосочетанияПримерыПримеры, ожидающие переводаВозможные однокоренные словаsecond перевод и транскрипция, произношение, фразы и предложенияглаголсуществительноеприлагательноечислительноеФормы глаголаФразыПредложенияДобавить комментарий Можем ли мы просто сказать: транскрипция во-вторых? Сохранить цитату в файл Добавить в коллекции Добавить в мою библиографию Ваш сохраненный поиск Создайте файл для внешнего программного обеспечения для управления цитированием Полнотекстовые ссылки Принадлежности Авторы Принадлежности Абстрактный Комментировать Похожие статьи Цитируется Типы публикаций термины MeSH Настройка обратной транскрипции | Термо Фишер Научный На этой странице: Видео: обучение упрощенной обратной транскрипции4 и обратному отбору7 900 900 правильные обратные транскриптазы и праймеры для вашего эксперимента. Подготовка матрицы РНК Видео: Ингибиторы обратной транскрипции Видео: Что такое коэффициент чистоты? Таблица 1. Рекомендации по измерению УФ-излучения для анализа РНК Удаление геномной ДНК Обращение к транскриптазе Выбор грунтовки Основные компоненты реакции Температура и время реакции Обратная транскрипция за 10 минут Синтез кДНК первой и второй цепи использованная литература перевод, произношение, транскрипция, примеры использования second амер. |ˈsekəndz| Тег audio не поддерживается вашим браузером. брит. |sɪˈkɒndz| Тег audio не поддерживается вашим браузером. — используется как present tense(he/she/it) для глагола to second— используется как мн.ч. для существительного secondМои примерыСловосочетания a controlleddemolitionduringwhich the entirebuildingimploded in a matter of seconds — контролируемый снос, во время которого всё здание рухнуло в считанные секунды to put five seconds of daylight — оторваться на пять секунд to have a lead of threemetres (five seconds) — опередить на три метра (на пять секунд) seconds counter — секундомер split-seconds chronograph — хронограф с двойной секундной стрелкой command 8 seconds of firing — выдавать команду на обработку импульса в течение 8 сек have a lead of five seconds — опережать на пять секунд; опередить на пять секунд; опережать на три метра run a hundredmetres in ten seconds flat — пробежать сто метров ровно за десять секунд double-hood seconds — секретер с двойной верхней секцией, разделённой перегородкой hundredcall seconds — сокращенный двухминутный разговор; сто телефонных вызовов в секунду seconds timer — секундомер Примеры Within seconds, Bev called back. Бев перезвонила через несколько секунд. Hold your breath for six seconds. Задержите дыхание на шесть секунд. The operation takes only 30 seconds. Операция занимает всего тридцать секунд. I ran 20.51 seconds for a personal best. Мой личный рекорд бега — 20,51 секунд. For a few seconds she gazed dumbly at him. Несколько секунд она молча и пристально смотрела на него. They got to the airport with seconds to spare. Они добрались до аэропорта за считанные секунды до отлёта. 10 seconds to blast-off. Десять секунд до старта. He finished 39 seconds ahead of his main rival. Он на 39 секунд опередил своего главного соперника. Wait several seconds before deploying the parachute. Подождите несколько секунд, прежде чем раскрывать парашют. Lewis equalled the old world record of 9.93 seconds. Льюис повторил старый мировой рекорд — 9,93 секунды. They timed the winner at 2 minutes and 14. 05 seconds. Победитель показал время 2 минуты 14.05 секунд. You have to hold the button down for several seconds. Необходимо в течение нескольких секунд удерживать кнопку нажатой. Her time was only 2 seconds short of the world record. Её результату не хватило двух секунд до мирового рекорда. She finished the race five seconds outside the record. Она финишировала в гонке со временем, на пять секунд хуже рекордного. With seconds left on the clock, she scored the winner. Она забила победный гол, когда до конца оставалось несколько секунд. The Canadians went into the lead after only 30 seconds. Всего через тридцать секунд после начала матча «Кэнэдиенз» вышли вперёд. A pendulum which will vibrate seconds in a true manner. Маятник, точно отмеряющий секунды. I’m going to give you five seconds to explain yourself. Я дам вам пять секунд, чтобы объясниться. The treasure is 2 minutes and 45 seconds south of here. Сокровище находится в двух минутах сорока пяти секундах к югу отсюда. She paused for a few seconds before crossing the street. Она остановилась на несколько секунд, прежде чем перейти улицу. These stockings are seconds and have some slight defects. Эти чулки второго сорта и имеют незначительные дефекты. With 15.7 seconds left, Washington State called time out. Когда до конца матча оставалось чуть меньше шестнадцати секунд, команда Вашингтон Стэйт попросила тайм-аут. After that sidewinder he was slaphappy for a few seconds. После такого удара он находился в состоянии шока в течение нескольких секунд. The opposition scored a goal in the last seconds of the game. Команда соперников забила гол на последних секундах игры. It took a few seconds for her eyes to adjust to the darkness. Несколько секунд её глаза привыкали к темноте. Jonson’s time of 9.3 seconds was just inside the world record. Результат Джонсона — 9,3 секунды — был чуть-чуть быстрее мирового рекорда. When you first open the bottle the beer will froth for a few seconds. Когда в первый раз открываешь бутылку пива, оно несколько секунд обильно пенится. Lift your head off the floor and hold this position for five seconds. Приподнимите голову над полом и удерживайте в этом положении в течение пяти секунд. (обращение к человеку который лежит на спине/животе) He finished in 10 minutes 22.4 seconds, 4 seconds outside the record. Он финишировал через десять минут двадцать две и четыре десятых секунды, что на четыре секунды хуже рекорда. He entered the house, and within seconds, he was surrounded by children. Он вошёл в дом, и всего через несколько секунд оказался в окружении детей. ещё 23 примера свернутьПримеры, ожидающие перевода Karen won in the 300 metres, clocking 42.9 seconds. They reached safety seconds before the bomb went off. After a few seconds, the door opened and Mrs Barnes invited me in. Для того чтобы добавить вариант перевода, кликните по иконке ☰, напротив примера.Возможные однокоренные словаsecond — второй, другой, второй, секунда, вторым номером, подкреплятьseconder — выступающий за проектsecondly — во-вторых, кроме того, к тому жеДополнение / ошибка Добавить примерВ других словарях: Мультитран Webster FreeDictionary Longman Forvo second перевод и транскрипция, произношение, фразы и предложенияПосмотрите слово second на новом сайте wordcards.ru! [ˈsekənd]глагол поддерживатьСинонимы: favour, buttress, backed, buoy, undershore, nurture, follow, fortify.существительное секунда (минута, мгновение, момент) вторая секундант помощникМнож. число: seconds.Синонимы: wizard, offsider, secy, aider, auxiliary, booster, candle-holder, succor, coadjutor, adjunct, cornerman, mate, contributor.прилагательное вторичный (повторный, дополнительный, второстепенный) второсортныйСинонимы: second-best, third-rate, inferior, second-chop, middling.числительное второйСинонимы: secondly, latter, secondary, another, other.Формы глаголаЕд. числоМнож. числоPresent Simple (Настоящее время)I secondWe secondYou secondYou secondHe/She/It secondsThey secondPast Simple (Прошедшее время)I secondedWe secondedYou secondedYou secondedHe/She/It secondedThey secondedФразыsecond floorвторой этажsecond of silenceсекунда тишиныsplit secondмгновение окаsecond appearanceВторичное появлениеsecond operationповторная операцияПредложенияHe took second place. Он занял второе место.If you translate from your second language into your own native language, rather than the other way around, you’re less likely to make mistakes.Если вы переводите с иностранного языка на ваш родной, а не наоборот, то менее вероятно, что вы сделаете ошибку.Their second album is much better than their first album.Их второй альбом гораздо лучше первого.China is now the world’s second largest economy.Китай сейчас — это вторая экономика в мире.There is a big difference between learning a language in order to understand or to say something if needed, and wanting to acquire a second language in order to command it freely, almost like you command your first language, your mother tongue.Существует большая разница между изучением языка, чтобы понять или сказать что-нибудь в случае необходимости, и усилиями, направленными на приобретение второго языка, чтобы говорить свободно, почти как на первом, на родном языке.Los Angeles is the second largest city in the United States.Лос-Анджелес — второй по величине город в Соединённых Штатах.The president said he would not run for the second term.Президент сказал, что он не будет баллотироваться на второй срок.Football was played in China in the second century.Во втором столетии в Китае играли в футбол.I realise that you are the second authority in Europe.Я осознаю, что вы — второй по влиянию человек в Европе.How many rooms are there on the second floor of your house?Сколько комнат на втором этаже твоего дома?He waited for several seconds and opened the door.Он подождал несколько секунд и открыл дверь.«OK, Kimi, the next car behind you is Alonso. Alonso five seconds behind you. I’ll keep you updated on the gap. I’ll keep you updated on the pace.» «Just leave me alone, I know what I’m doing!»«Окей, Кими, машина позади тебя — Алонсо. Алонсо в пяти секундах позади. Буду держать тебя в курсе по отставанию. Буду держать тебя в курсе по скорости». — «Просто оставь меня в покое, я знаю, что делаю!»You have ten seconds left to live.Тебе осталось жить десять секунд.A few seconds ago I was in the open air and the bright daylight, and now my eyes refuse to serve me in this darkness.Несколько секунд тому назад я ещё был под открытым небом, в ярком свете дня, и теперь глаза отказывались служить мне в этом мраке.You’ve only got thirty seconds to explain yourself.У тебя всего тридцать секунд, чтобы объясниться.The video claims to be fifty-one seconds long, but it is in fact over 9000 eternities in Ganon’s pit!Это видео заявляет длительность в пятьдесят одну секунду, но на самом деле в нём более 9000 вечностей в западне Гэнона!After eleven seconds they can cross the street.Через одиннадцать секунд они могут перейти улицу.There are sixty seconds in a minute. В минуте 60 секунд.Добавить комментарийНа данной странице следует оставлять комментарии, относящиеся к слову second. Текст комментария может быть только на русском или английском языке.Для общих комментариев по сайту следует использовать раздел Отзывы и предложения.Следующие комментарии () Можем ли мы просто сказать: транскрипция во-вторых? Сохранить цитату в файл Формат: Резюме (текст)PubMedPMIDAbstract (текст)CSV Добавить в коллекции Создать новую коллекцию Добавить в существующую коллекцию Назовите свою коллекцию: Имя должно содержать менее 100 символов Выберите коллекцию: Не удалось загрузить вашу коллекцию из-за ошибки Повторите попытку Добавить в мою библиографию Моя библиография Не удалось загрузить делегатов из-за ошибки Повторите попытку Ваш сохраненный поиск Название сохраненного поиска: Условия поиска: Тестовые условия поиска Эл. адрес: (изменить) Который день? Первое воскресеньеПервый понедельникПервый вторникПервая средаПервый четвергПервая пятницаПервая субботаПервый деньПервый рабочий день Который день? ВоскресеньеПонедельникВторникСредаЧетвергПятницаСуббота Формат отчета: SummarySummary (text)AbstractAbstract (text)PubMed Отправить максимум: 1 шт. 5 шт. 10 шт. 20 шт. 50 шт. 100 шт. 200 шт. Отправить, даже если нет новых результатов Необязательный текст в электронном письме: Создайте файл для внешнего программного обеспечения для управления цитированием Полнотекстовые ссылки Эльзевир Наука Полнотекстовые ссылки Комментарий . 2017 6 апреля; 169(2):184-185. doi: 10.1016/j.cell.2017.03.026. Питер Хьюго Лодевийк Крийгер 1 , Вутер-де-Лат 2 Принадлежности 1 Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Netherlands. 2 Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Netherlands. Электронный адрес: [email protected]. PMID: 28388402 DOI: 10. 1016/j.cell.2017.03.026 Бесплатная статья Комментарий Peter Hugo Lodewijk Krijger et al. Клетка. 2017 . Бесплатная статья . 2017 6 апреля; 169(2):184-185. doi: 10.1016/j.cell.2017.03.026. Авторы Питер Хьюго Лодевийк Крийгер 1 , Вутер-де-Лат 2 Принадлежности 1 Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Netherlands. 2 Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Netherlands. Электронный адрес: [email protected]. PMID: 28388402 DOI: 10.1016/j.cell.2017.03.026 Абстрактный Поразительная корреляция между топологией генома и транскрипционной активностью на протяжении десятилетий заставляла исследователей вновь возвращаться к вопросу: «Форма следует за функцией или функция следует за формой?» В новом исследовании Hug et al. ответьте на этот вопрос, сравнив время активации зиготического генома с появлением структур генома во время эмбриогенеза дрозофилы. Copyright © 2017 Elsevier Inc. Все права защищены. Комментировать Архитектура хроматина возникает во время активации зиготического генома независимо от транскрипции. Hug CB, Grimaldi AG, Kruse K, Vaquerizas JM. Hug CB и др. Клетка. 2017 6 апреля; 169(2):216-228.e19. doi: 10.1016/j.cell.2017.03.024. Клетка. 2017. PMID: 28388407 Похожие статьи Транскрипционные и эпигенетические признаки активации зиготического генома во время раннего эмбриогенеза дрозофилы. Дарбо Э., Херрманн С., Лекуит Т., Тиффри Д., ван Хелден Дж. Дарбо Э. и др. Геномика BMC. 2013 5 апр; 14:226. дои: 10.1186/1471-2164-14-226. Геномика BMC. 2013. PMID: 23560912 Бесплатная статья ЧВК. Гистоновый таймер для активации зиготического генома. Сириако Г., Тамкун Дж.В. Сириако Г. и др. Ячейка Дев. 2013 30 сентября; 26 (6): 558-9. doi: 10.1016/j.devcel.2013.09.015. Ячейка Дев. 2013. PMID: 24091009 Регуляция и функция продуктов материнских генов при переходе от матери к зиготе у дрозофилы. Лавер Д.Д., Марсоле А.Дж., Смиберт К.А., Липшиц Х.Д. Лейвер Дж. Д. и соавт. Curr Top Dev Biol. 2015;113:43-84. doi: 10.1016/bs.ctdb.2015.06.007. Epub 2015 14 августа. Curr Top Dev Biol. 2015. PMID: 26358870 Обзор. Транскрипционная активация зиготического генома дрозофилы. Харрисон М.М., Эйзен М.Б. Харрисон М.М. и др. Curr Top Dev Biol. 2015;113:85-112. doi: 10.1016/bs.ctdb.2015.07.028. Epub 2015 19 августа. Curr Top Dev Biol. 2015. PMID: 26358871 Обзор. Полногеномный анализ перехода от матери к зиготе в примордиальных зародышевых клетках дрозофилы. Сиддики Н.У., Ли Х., Луо Х., Караискакис А., Хоу Х., Кислингер Т., Вествуд Дж.Т., Моррис К., Липшиц Х.Д. Сиддики Н.Ю. и др. Геном биол. 2012 февраль 20;13(2):R11. doi: 10.1186/gb-2012-13-2-r11. Геном биол. 2012. PMID: 22348290 Бесплатная статья ЧВК. Посмотреть все похожие статьи Цитируется Типы клеток как виды: изучение метафоры. Дойл Дж. Дж. Дойл Дж. Фронт завод науч. 2022 авг 22;13:868565. doi: 10.3389/fpls.2022.868565. Электронная коллекция 2022. Фронт завод науч. 2022. PMID: 36072310 Бесплатная статья ЧВК. Обзор. Архитектура хроматина 4q-D4Z4 регулирует транскрипцию генов мышечной атрофии при фацио-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии. Cortesi A, Pesant M, Sinha S, Marasca F, Sala E, Gregoretti F, Antonelli L, Oliva G, Chiereghin C, Soldà G, Bodega B. Кортези А. и др. Геном Res. 2019 июнь; 29 (6): 883-895. doi: 10.1101/гр.233288.117. Эпаб 2019 16 мая. Геном Res. 2019. PMID: 31097473 Бесплатная статья ЧВК. Изменения в организации генома паразитоспецифических семейств генов на стадиях передачи Plasmodium. Бунник Э. М., Кук К.Б., Вароко Н., Батугедара Г., Прюдом Дж., Корт А., Ши Л., Андолина С., Росс Л.С., Брэди Д., Фидок Д.А., Ностен Ф., Тевари Р., Синнис П., Ай Ф., Верт Дж.П., Ноубл В.С., Ле Рох К.Г. Бунник Е.М. и соавт. Нац коммун. 2018 15 мая; 9 (1): 1910. doi: 10.1038/s41467-018-04295-5. Нац коммун. 2018. PMID: 29765020 Бесплатная статья ЧВК. Конвейер фармакоэпигеномной информатики определяет путь новых и известных вариантов фармакогеномики варфарина. Allyn-Feuer A, Ade A, Luzum JA, Higgins GA, Athey BD. Аллин-Фойер А. и соавт. Фармакогеномика. 2018 апр; 19 (5): 413-434. doi: 10.2217/pgs-2017-0186. Epub 2018 5 февраля. Фармакогеномика. 2018. PMID: 29400612 Бесплатная статья ЧВК. Типы публикаций термины MeSH Полнотекстовые ссылки Эльзевир Наука Укажите Формат: ААД АПА МДА НЛМ Отправить на Настройка обратной транскрипции | Термо Фишер Научный В экспериментах по молекулярной биологии обратная транскрипция в первую очередь проводится для создания комплементарных ДНК (кДНК), представляющих ткане- или клеточно-специфические популяции РНК. Чтобы эксперименты были успешными, необходимо учитывать важные факторы, связанные с матрицей, реагентами и условиями реакции. На этой странице: Подготовка матрицы РНК Удаление геномной ДНК Обращение к обратной транскриптазе Выбор праймеров Основные компоненты реакции Температура и время реакции Синтез кДНК первой и второй цепей Ссылки Ресурсы Видео: обучение упрощенной обратной транскрипции4 и обратному отбору7 900 900 правильные обратные транскриптазы и праймеры для вашего эксперимента. Подготовка матрицы РНК РНК служит матрицей в обратной транскрипции. Полная РНК обычно используется в синтезе кДНК для последующих приложений, таких как RT-(q)PCR, тогда как определенные типы РНК (например, матричная РНК (мРНК) и малые РНК, такие как микроРНК) могут быть обогащены для определенных приложений, таких как создание библиотеки кДНК. и профилирование микроРНК. Поддержание целостности РНК имеет решающее значение и требует особых мер предосторожности во время выделения, обработки, хранения и экспериментального использования. Передовые методы предотвращения деградации РНК включают ношение перчаток, пипетирование наконечниками с аэрозольным барьером, использование лабораторного оборудования и реагентов, не содержащих нуклеазы, а также обеззараживание рабочих зон. Для выделения и очистки РНК доступны различные стратегии в зависимости от типа исходных материалов (например, кровь, ткани, клетки, растения) и целей экспериментов. Основными целями рабочих процессов выделения являются стабилизация молекул РНК, ингибирование РНКаз и максимальное увеличение выхода с помощью надлежащих методов хранения и экстракции. Оптимальные методы очистки удаляют из растительных тканей эндогенные соединения, такие как сложные полисахариды и гуминовые кислоты, которые мешают активности ферментов, и обычные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как соли, ионы металлов, этанол и фенол. После очистки РНК следует хранить при температуре –80°C с минимальными циклами замораживания-оттаивания. Видео: Ингибиторы обратной транскрипции Узнайте об ингибиторах обратной транскриптазы, механизмах их ингибирования и советы по преодолению ингибиторов обратной транскрипции. Существует несколько методов оценки качества и количества РНК после очистки. Распространенным подходом является УФ-спектроскопия для измерения поглощения на определенных длинах волн. Количество РНК можно определить по поглощению при 260 нм с использованием закона Бера-Ламберта, а о наличии или отсутствии определенных примесей можно судить по соотношению поглощений при разных длинах волн (9).0284 Таблица 1 ). Обратите внимание, что УФ-поглощение не специфично только для РНК, поскольку все нуклеиновые кислоты поглощают УФ-излучение с одинаковыми длинами волн. Для более специфичного и чувствительного анализа РНК можно рассмотреть флуоресцентный анализ с красителями, которые испускают сигнал только тогда, когда они специфически связаны с молекулами-мишенями. Видео: Что такое коэффициент чистоты? Узнайте об определении чистоты пробы по абсорбции и расчете соотношений A260/A280. Таблица 1. Рекомендации по измерению УФ-излучения для анализа РНК Absorbance Indicates presence of: Target ratios 230 nm Organic compounds, sugars, urea, salts A 260 /A 230 > 1.8 260 nm All nucleic acids A 260 ≈ 0.1–1.0 270 nm Phenol A 260 / A 270 > 1.0 280 nm Protein RNA: A 260 /A 280 ≈ 2.0 DNA: A 260 /A 280 ≈ 1.8 330 nm Light scattering A 330 = 0 Целостность РНК можно оценить путем сравнения 28S и 18S рибосомных РНК (рРНК) как представления общей РНК. Тотальную РНК денатурируют, а затем разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза, который по своей природе является качественным. Затем оценивают соотношение интенсивностей 28S рРНК и 18S рРНК с соотношением 2:1, указывающим на интактную РНК (9).0284 Рисунок 1A ). Более количественный метод, разработанный Agilent Technologies, сочетает в себе микрофлюидику и запатентованный алгоритм для оценки целостности РНК. Этот метод дает цифровое считывание, называемое числом целостности РНК или RIN, где значения в диапазоне от 8 до 10 указывают на высокое качество РНК [1,2] (, рис. 1B, ). Рис. 1. Анализ целостности РНК с помощью (A) гель-электрофореза и (B) микрофлюидики. Удаление геномной ДНК Иногда следовые количества геномной ДНК (гДНК) могут быть очищены совместно с РНК. Загрязнение гДНК может мешать обратной транскрипции и может привести к ложноположительным результатам, более высокому фону или более низкому уровню обнаружения в чувствительных приложениях, таких как RT-qPCR. ДНКазу I обычно добавляют к выделенной РНК для элиминации гДНК. ДНКазу I необходимо полностью удалить перед проведением ОТ-ПЦР, поскольку любой остаточный фермент будет разрушать одноцепочечную ДНК, например праймеры и синтезированную кДНК. Часто инактивация ДНКазы I (например, обработка ЭДТА и нагревание) или процедуры удаления фермента приводят к деградации РНК или потере образца. В качестве альтернативы ДНКазе I доступны двухцепочечные ДНКазы для удаления загрязняющих гДНК без воздействия на РНК или одноцепочечные ДНК. Их термолабильность позволяет легко инактивировать их при относительно мягкой температуре (например, 55°C) без отрицательных воздействий. Такие двухцепочечные термолабильные ДНКазы можно инкубировать с РНК в течение 2 минут при 37°C перед реакцией обратной транскрипции, чтобы оптимизировать рабочий процесс (, рис. 2, ). Рис. 2. Процедуры удаления гДНК: ДНКаза I в сравнении с ферментом ezDNase от Invitrogen. По сравнению с ДНКазой I фермент ezDNase обеспечивает более короткий рабочий процесс, более простую процедуру и меньшее повреждение РНК. Инактивация фермента ezDNase перед обратной транскрипцией необязательна, поскольку фермент не расщепляет праймеры, одноцепочечную РНК или комплексы кДНК:РНК. Обращение к транскриптазе Класс ферментов, известных как обратные транскриптазы, синтезирует комплементарную ДНК с использованием РНК в качестве матрицы, но они могут различаться по функциональной активности и свойствам. Их свойства влияют на их способность к обратной транскрипции длинных транскриптов РНК, РНК, богатой GC, РНК со значительными вторичными структурами и РНК субоптимального качества. ( Информационный документ: Сравнение эффективности обратных транскриптаз) Большинство обратных транскриптаз, используемых в молекулярной биологии, происходят из гена pol вируса птичьего миелобластоза (AMV) или вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV). Обратная транскриптаза AMV была одним из первых ферментов, выделенных для синтеза кДНК в лаборатории. Фермент представляет собой гетеродимер с молекулярной массой 170 кДа с оптимальным интервалом температур реакции 42–48°С. Обратная транскриптаза AMV обладает сильной активностью РНКазы H, которая расщепляет РНК в гибридах РНК:кДНК, что приводит к более коротким фрагментам кДНК (<5 т.п.н.). Обратная транскриптаза MMLV стала популярной альтернативой благодаря своей мономерной структуре, которая позволяла упростить клонирование и модификации рекомбинантного фермента. Обратная транскриптаза MMLV представляет собой фермент с молекулярной массой 75 кДа с оптимальной температурой реакции около 37°C. Хотя она менее термостабильна, чем обратная транскриптаза AMV, обратная транскриптаза MMLV способна синтезировать более длинные кДНК (<7 т.п.н.) с более высокой эффективностью из-за меньшей активности РНКазы Н [3]. Для дальнейшего улучшения синтеза кДНК была сконструирована обратная транскриптаза MMLV для еще более низкой активности РНКазы H (т. е. мутантный домен РНКазы H или RNaseH 9).0069 – ), повышенной термостабильностью (до 55°С) и повышенной технологичностью (в 65 раз выше). Эти свойства приводят к увеличению длины и выхода кДНК, более высокой чувствительности, улучшенной устойчивости к ингибиторам и более быстрому времени реакции (, таблица 2, ) [4]. ( Подробнее: атрибуты обратной транскриптазы) Таблица 2. Общие обратные транскриптазы и их атрибуты. Обратная транскриптаза AMV MMLV reverse transcriptase Engineered MMLV reverse transcriptase (e.g., Invitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase) RNase H activity High Medium Low Reaction temperature (highest recommended) 42°C 37°C 55°C Время реакции 60 мин 5 мин 60 мин0304 10 min Target length ≤5 kb ≤7 kb ≤12 kb Relative yield (with challenging or suboptimal RNA) Medium Low Высокий Выбор грунтовки Чтобы инициировать обратную транскрипцию, обратным транскриптазам требуется короткий олигонуклеотид ДНК, называемый праймером, который связывается с комплементарными последовательностями на матрице РНК и служит отправной точкой для синтеза новой цепи. В зависимости от матрицы РНК и последующего применения доступны праймеры трех основных типов: олиго(dT) праймеры, случайные праймеры и ген-специфические праймеры (9).0284 Рисунок 3 ). Рисунок 3. Общие праймеры, используемые в обратной транскрипции. Олиго(dT) праймеры состоят из фрагмента из 12–18 дезокситимидинов, которые отжигаются с поли(А)-хвостами эукариотических мРНК, которые составляют лишь 1–5% от общей РНК. Эти праймеры являются оптимальным выбором для конструирования библиотек кДНК из эукариотических мРНК, клонирования полноразмерной кДНК и быстрой 3′-амплификации концов кДНК (3′-RACE). Из-за своей специфичности в отношении поли(А)-хвостов олиго(dT)-праймеры не подходят для деградированных РНК, например, из образцов, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE), а также для РНК, у которых отсутствуют поли(А)-хвосты, такие как как прокариотические РНК и микроРНК. Поскольку синтез кДНК начинается с 3′-поли(А)-хвоста, олиго(dT)-праймеры потенциально могут вызывать смещение 3′-конца. РНК со значительной вторичной структурой может также нарушать синтез полноразмерной кДНК, что приводит к недостаточному представлению 5′-концов. Праймеры Oligo(dT) могут быть модифицированы для повышения эффективности обратной транскрипции. Например, длина олиго(dT) праймеров может быть увеличена до 20 нуклеотидов или более, чтобы сделать возможным их отжиг в реакциях обратной транскрипции при более высоких температурах. В некоторых случаях олиго(dT) праймеры могут включать вырожденные основания, такие как dN (dA, dT, dG или dC) и dV (либо dG, dA, либо dC) на 3′-конце. Эта модификация предотвращает проскальзывание поли(А) и блокирует сайт праймирования непосредственно перед хвостом поли(А). Эти праймеры называются заякоренный олиго(dT) . Случайные праймеры представляют собой олигонуклеотиды со случайными последовательностями оснований. Они часто имеют длину шесть нуклеотидов и обычно называются случайными гексамерами, N 6 или dN 6 . Из-за их случайного связывания (т.е. отсутствия специфичности к матрице) случайные праймеры потенциально могут отжигаться с любыми видами РНК в образце. Следовательно, эти праймеры можно рассматривать для обратной транскрипции РНК без поли(А)-хвостов (например, рРНК, тРНК, некодирующих РНК, малых РНК, прокариотических мРНК), деградированных РНК (например, из ткани FFPE) и РНК с известные вторичные структуры (например, вирусные геномы). Хотя случайные праймеры помогают улучшить синтез кДНК для обнаружения, они не подходят для полноразмерной обратной транскрипции длинной РНК. Увеличение концентрации случайных гексамеров в реакциях обратной транскрипции повышает выход кДНК, но приводит к получению более коротких фрагментов кДНК из-за увеличения связывания в нескольких сайтах на одной и той же матрице (, рис. 4, ). Более того, использование только случайных праймеров может быть не идеальным для некоторых применений ОТ-ПЦР. Например, переоценка числа копий мРНК является одной из проблем [5]. Смесь oligo(dT) и случайных праймеров часто используется в двухэтапной ОТ-ПЦР для достижения преимуществ каждого типа праймеров. Для анализа экспрессии микроРНК (миРНК) случайные гексамеры не подходят, и необходимо разработать специальные праймеры для обратной транскрипции микроРНК [6,7]. Рис. 4. Длина и выход кДНК зависят от выбора и концентрации праймера. РНК размером 6,4 т.п.н. с поли(А)-хвостом была обратно транскрибирована в двухцепочечную (дц) кДНК с использованием олиго(дТ) праймера или случайных гексамеров в различных концентрациях. Результаты анализировали электрофорезом в агарозном геле. Увеличение концентрации случайных гексамеров приводило к более высокой концентрации коротких кДНК по сравнению с более дискретными, более длинными продуктами транскрипции с олиго(dT) праймерами. Ген-специфические праймеры обеспечивают наиболее специфический прайминг в обратной транскрипции. Эти праймеры разработаны на основе известных последовательностей РНК-мишени. Поскольку праймеры связываются со специфическими последовательностями РНК, для каждой РНК-мишени необходим новый набор ген-специфических праймеров. В результате для анализа нескольких РНК-мишеней требуется больше РНК. Генеспецифические праймеры обычно используются в приложениях одноэтапной ОТ-ПЦР. ( Технический документ: Усовершенствованная система одноэтапной ОТ-ПЦР) Таблица 3. Сравнение распространенных праймеров для обратной транскрипции. Oligo(dT) Random hexamers Oligo(dT) + random hexamers Gene-specific primer Typical final concentration 2–5 µM 2 –5 мкМ 1–2 мкМ каждый 0,5–1 мкМ Расширение препраймера при 25°C —— Ключевые преимущества . преимущества oligo(dT) и случайных праймеров Обратная транскрипция, специфичная для интересующего гена Основные компоненты реакции Помимо фермента и праймеров, основными компонентами реакции для обратной транскрипции являются матрица РНК (предварительно обработанная для удаления геномной ДНК), буфер, dNTP, DTT, ингибитор РНКазы и вода, не содержащая РНКазы ( Рисунок 5 ). Рисунок 5. Реакция обратной транскрипции с ее основными компонентами. Матрицу РНК готовят, как описано в предыдущих разделах. В таблице 4 представлен рекомендуемый диапазон вводимой РНК для реакций обратной транскрипции, а оптимальное количество зависит от преобладания целевой последовательности и чувствительности обратной транскриптазы. Таблица 4. Рекомендуемые диапазоны количества вводимой РНК в реакциях обратной транскрипции. RNA template Recommended range Total RNA 10 pg–5 μg Poly(A) RNA 10 pg–0. 5 μg Specific RNA 0.01 пг–0,5 мкг Реакционный буфер поддерживает благоприятные для реакции рН и ионную силу. Поставляемый буфер может также содержать добавки для повышения эффективности обратной транскрипции. dNTPs обычно должны быть в концентрации 0,5–1 мМ каждый, предпочтительно в эквимолярной концентрации. Для обеспечения качественной обратной транскрипции рекомендуется использовать свежеразведенные высококачественные dNTP. DTT , восстанавливающий реагент, часто включается для оптимальной активности фермента. Эффективность реакции может быть снижена, если DTT или другие добавки выпадают в осадок; следовательно, компоненты реакции должны быть растворены и хорошо перемешаны.Ингибитор РНКазы обычно включают в реакционный буфер или добавляют в реакцию обратной транскрипции для предотвращения деградации РНК. РНКазы могли быть совместно очищены во время выделения или введены во время подготовки реакции. Существует ряд известных РНКаз, и соответствующие ингибиторы РНКазы следует выбирать на основе их механизма действия и требований к реакции. Вода, используемая в реакциях обратной транскрипции, не должна содержать нуклеазы. Рекомендуется вода из коммерческого источника, не содержащая нуклеаз, или вода, обработанная DEPC (диэтилпирокарбонатом) для удаления любых РНКаз. Загрязняющие РНКазы не могут быть удалены простой фильтрацией, а автоклавированная вода не подходит, поскольку РНКазы термостабильны. Температура и время реакции Реакции обратной транскрипции включают три основных этапа: отжиг праймеров, полимеризацию ДНК и дезактивацию фермента (, рис. 6, ). Температура и продолжительность этих стадий зависят от выбора праймера, РНК-мишени и используемой обратной транскриптазы. Рис. 6. Три основных этапа синтеза кДНК. Отжиг праймеров: Праймер смешивают с матрицей РНК, нагревают до 65°C в течение 5 мин, затем инкубируют на льду не менее 1 мин. Это помогает гарантировать, что РНК является одноцепочечной и что праймер эффективно отжигает мишень. После отжига добавляют обратную транскриптазу и необходимые компоненты (например, буфер, дНТФ, ингибитор РНКазы). Полимеризация ДНК: На этом этапе температура и продолжительность реакции могут варьироваться в зависимости от выбора праймера и используемой обратной транскриптазы. С олиго(dT) праймером (Tm ~35–50°C) реакцию можно инкубировать непосредственно при оптимальной температуре обратной транскриптазы (37–50°C). Случайные гексамеры обычно имеют более низкую Tm (~ 10–15 ° C) из-за их меньшей длины. Поэтому, когда используются случайные гексамеры (отдельно или в сочетании с олиго(dT)), мы рекомендуем инкубировать реакцию обратной транскрипции при комнатной температуре (~ 25 ° C) в течение 10 минут после добавления фермента для продления праймеров. Среди обратных транскриптаз существуют различия в термостабильности, которая, в свою очередь, определяет наивысшую оптимальную температуру полимеризации для каждой из них. Использование термостабильной обратной транскриптазы позволяет при более высокой температуре реакции (например, 50 °C) способствовать денатурации РНК с высоким содержанием GC или вторичных структур без влияния на активность фермента (, рисунок 7, ). Инкубация при высокой температуре с такими ферментами может привести к увеличению выхода, длины и представительства кДНК. ( Белая бумага: Исследования производительности обратной транскриптазы SuperScript IV) Время полимеризации зависит от процессивности обратной транскриптазы, которая относится к количеству нуклеотидов, включенных в одно событие связывания. Например, обратной транскриптазе MMLV дикого типа с низкой процессивностью часто требуется >60 мин для синтеза кДНК. Напротив, сконструированной обратной транскриптазе с высокой процессивностью может потребоваться всего 10 минут для синтеза кДНК размером 9 т.п.н. ( Узнать больше о процессивность обратной транскриптазы). Рис. 7. Влияние термостабильности и ее влияние на активность обратной транскриптазы. Образцы, содержащие РНК различной длины, подвергали обратной транскрипции с использованием олиго(dT) праймеров и меченных радиоактивным изотопом dNTP. Продукты реакции разделяли с помощью гель-электрофореза и визуализировали с помощью авторадиографии. Термостабильная обратная транскриптаза дает высокие выходы кДНК даже при температуре выше 50°C. Обратная транскрипция за 10 минут Узнайте, как добиться обратной транскрипции за 10 минут с помощью высокопроцессивной обратной транскриптазы. Деактивация фермента: Заключительный этап в реакциях обратной транскрипции заключается в деактивации обратной транскриптазы. Температура дезактивации может находиться в диапазоне 70-85°С, в зависимости от термостабильности фермента. Деактивация обычно проводится в течение 5–15 минут, при более высокой температуре требуется меньше времени. Синтез кДНК первой и второй цепи Синтез кДНК из матрицы РНК, как описано в предыдущем разделе, дает гибрид кДНК:РНК. Этот процесс упоминается как синтез первой цепи кДНК . Если присутствует активность РНКазы H (как в обратных транскриптазах AMV и MMLV дикого типа), РНК гибрида кДНК:РНК расщепляется во время синтеза первой цепи. кДНК первой цепи (с гибридизированной с ней РНК или без нее) можно использовать непосредственно в некоторых приложениях, таких как ОТ-ПЦР, где термостабильная ДНК-полимераза (например, ДНК-полимераза Taq ) реплицирует комплементарную цепь кДНК. При конструировании библиотеки кДНК и секвенировании кДНК первой цепи используется в качестве матрицы для создания двухцепочечной кДНК, представляющей РНК-мишени. Этот процесс известен как синтез второй цепи кДНК . При синтезе кДНК второй цепи рекомендуются обратные транскриптазы с минимальной активностью РНКазы Н, чтобы максимизировать длину и выход кДНК. Для синтеза двухцепочечной кДНК часто используют другую ДНК-полимеразу (например, ДНК-полимеразу Т7, ДНК-полимеразу I, Taq ДНК-полимераза) для получения комплементарной цепи первой цепи кДНК. В синтез двухцепочечной кДНК могут быть включены дополнительные ферменты, такие как ферменты, перечисленные ниже для модифицированного метода Гублера и Хоффмана [8] (, рис. 8, ). Рис. 8. Синтез двухцепочечной кДНК по методу Гублера-Хоффмана. E. coli РНКаза H разрывает нити РНК комплексов кДНК:РНК, обеспечивая 3′-ОН сайты праймирования для синтеза ДНК. E. coli ДНК-полимераза I удлиняет цепи РНК с разрывами за счет 5’3′-полимеразной активности и заменяет цепь РНК в направлении синтеза за счет 5’3′-экзонуклеазной активности в процессе, известном как . ник перевод . E. coli ДНК-лигаза запечатывает разрывы между вновь синтезированными сегментами кДНК. (ДНК-лигазу Т4 не следует использовать в качестве замены, поскольку она может лигировать двухцепочечные фрагменты кДНК с тупыми концами и образовывать химерные структуры.) ДНК-полимераза T4 затупляет концы двухцепочечной кДНК (необязательно на последнем этапе). В заключение, успех обратной транскрипции сильно зависит от компонентов и условий реакции. Реакции следует проводить надлежащим образом, чтобы они соответствовали интересующим последующим приложениям. использованная литература Шредер А., Мюллер О., Стокер С. и др. (2006) RIN: номер целостности РНК для присвоения значений целостности измерениям РНК. ВМС Мол Биол 7:3. Мюллер О., Лайтфут С., Шредер А. (2016) Номер целостности РНК (RIN) – Стандартизация контроля качества РНК. Публикация Agilent Technologies 5989-1165EN. Invitrogen Corp. (2002 г.) Высокопроизводительный RT для надежности в каждом эксперименте. (Брошюра) Thermo Fisher Scientific (2015) Обратная транскриптаза SuperScript IV. (Белая книга) Zhang J, Byrne CD (1999) Дифференциальное праймирование матриц РНК во время синтеза кДНК заметно влияет как на точность, так и на воспроизводимость количественной конкурентной ПЦР с обратной транскриптазой.